Nährbodenherstellung

notwendige Geräte und Utensilien:

• Becherglas 250 ml
• Spirituskocher (z.B. Esbitkocher)
• Briefwaage
• Glastrichter (nicht unbedingt nötig)
• Küchenherd mit Backrohr
• Impföse oder ähnliches zum Umrühren des Mediums

notwendiges Verbrauchsmaterial:

• Kulturgläser
• Küchenrolle
• Destilliertes Wasser
• Klebeschilder
• Agar-Agar Pulver (falls es nicht im Pulver des Mediums schon enthalten ist)
• Nährmedium
• Aluminium Folie

Bezugsquellen und genaue Infos sind der Liste "Utensilien für in vitro Aussaat" zu entnehmen.

Kulturgefässe für die Aussaat (Muttergefässe)

Eprovetten sind für Aussaat ideal weil diese sehr wenig Platz einnehmen und sich beim Umlegen der Protokorme in grössere Gefässe nur sehr wenig erhitzen. Würde man für die Aussaat kurze Gefässe verwenden, dann liegen diese beim Umlegen komplett im Dampfstrom und erwärmen sich so sehr rasch was den Protokormen nicht gut bekommt. Verwendet man Eprovetten als Muttergefäss, dann kann das Medium mit den Protokormen über den Topfrand herausragen während die Öffnung im Dampfstrom bleibt.

Kulturgefässe fürs Umlegen

Man sollte darauf achten, dass die Gläser keine zu grosse Öffnung haben und die Höhe der Gläser mindestens 10 cm beträgt. Verwendet man Gläser mit grösseren Öffnungen als 10 cm, dann steigt das Kontaminationsrisiko stark an weil der Platz im Dampfstrom nur begrenzt ist und sehr leicht insterile Umgebungsluft in das Glas gelangt. Die Höhe der Gläser sollte 10 cm nicht unterschreiten weil sonst die Pflanzen sehr bald am Deckel anstehen und das Wachstum verlangsamen bzw. einstellen. Wir bevorzugen die Gläser von Babynahrung (z.B. HIPP, Alete, ...).

Vorbereiten der Kulturgläser

Bevor man die Gläser für die in vitro Kultur verwenden kann, muß man diese gründlich von Etiketten und eventuell vorhandenen Speiseresten (Marmelade, ...) reinigen. Hierfür eigenen sich Lösungsmittel (z.B. Nitroverdünnung) recht gut wobei aber wichtig ist, dass die Gläser nach dem Reinigen gut abgewaschen werden um Lösungsmittelrückstände zu entfernen. Der Deckel sollte gut schließen und darf beim Reinigen nicht vergessen werden. Die sauberen Gläser werden jetzt mit einem Stück Küchenrolle trockengerieben und verschlossen bis zu deren Einsatz aufbewahrt. Da das Trockenreiben von Eprovetten (speziell die Innenseite) eher mühselig ist spülen wir unsere Eprovetten nach dem Waschen mit destilliertem Wasser aus, trocknen nur die Aussenseite ab und lassen sie an der Luft trocknen. So vermeiden wir lästige Kalkflecken in den Eprovetten und ersparen uns das Trockenreiben der Innenseite.

WICHTIG: Da die Gläser bei Sterilisieren im Backrohr ca. 150 Grad aushalten müssen, sind sie auf deren Tauglichkeit zu überprüfen. Die Gläser dürfen keinen Kunststoffdeckel haben.

Einmaliges Vorbereiten des Esbitkochers

Grundsätzlich kann jeder Bunsenbrenner, Spirituskocher oder ähnliches für das Erhitzen des Mediums eingesetzt werden. Wir bevorzugen den Esbitkocher, weil dieser Trockenbrennstofftabletten verwendet und diese geruchsneutral sind.
Da der Esbitkocher keine gute Fläche zum Abstellen des 250 ml Becherglases bietet, haben wir bei unserem mit einem Seitenschneider 4 Kerben in die Seitenteile geschnitten, in die die beiden Stahldrahtstücke gelegt werden. Die beiden Stahldrähte bilden bei mir die Fläche zum Abstellen des 250ml Becherglases über der Flamme.

Ansetzen des Nährbodens (Medium)

1. Die notwendige Menge an Pulver für den Nährboden (siehe Beipackzettel oder Aufdruck auf der Flasche) mit Hilfe einer Briefwaage abwiegen.

2. Ist im Medium kein Geliermittel enthalten (siehe Beipackzettel), dann muss man noch Agar-Agar Pulver vorbereiten. Wir verwenden für unsere Nährböden 6 - 7 Gramm Agar-Agar pro Liter Medium.

3. Das Backrohr einschalten und auf 150 Grad vorheizen.

4. Etwa 2/3 der gewünschte Menge destillierte Wasser in das Becherglas füllen und das Nährbodenpulver einrühren.

5. Solange destilliertes Wasser zugeben bis die endgültige Menge erreicht ist und danach noch einmal gut umrühren.

6. Den pH-Wert mit Hilfe von Teststreifen oder pH-Meter feststellen. Der pH-Wert sollte bei ca. 5.6 liegen. Ist der Wert niedriger, dann kann man durch vorsichtiges Hinzugeben von NaOH den pH-Wert erhöhen. Ist der pH-Wert zu hoch, dann kann man diesen durch vorsichtiges Hinzugeben von HCl senken. Der Sigma Nährboden P6668 ist voreingestellt und muss nicht umbedingt kontrolliert.

7. Jetzt kann man das Becherglas auf den Spirituskocher stellen und das Medium erhitzen.

8. Sobald die ersten Dampfblasen vom Boden des Becherglases aufsteigen kann man mit dem Einrühren des Agar-Agar Pulver beginnen (falls dieses nicht schon im Nährbodenpulver enthalten ist).

9. Das Medium ca. 2 Minuten leicht kochen lassen wobei man aber darauf achten muss, dass das Medium nicht aufschäumt.

10. Den flüssigen Nährboden in die Kulturgefässe füllen und darauf achten, dass das Nährmedium nicht auf den Hals der Kulturgefässe kommt weil sonst Kontaminationen (Pilze, ...) sehr leicht in das Gefäss kommen können. Bei sehr engen Gefässen (z.B. Eprovetten, Flaschen, ...) ist ein Glastrichter sehr zu empfehlen.

11. Den Deckel der Kulturgefässe auf die befüllten Gläser legen, aber nicht festschrauben weil im Backrohr durch die Hitze ein Überdruck im Kulturglas entsteht der das Glas beschädigen könnte wenn dieses fest verschlossen ist. Hat das Gefäss (z.B. Eprovette, Flasche) keinen hitzebeständigen Schraubverschluss, dann muss man in die Öffnung einen Wattpfropfen stecken.

12. Im nächsten Schritt werden die Gefässe mit Alufolie abgedeckt und ins vorgeheizte Backrohr gestellt. Bei Eprovetten ist es empfehlenswert diese in ein Drahtgestell zu stellen und dieses mit Alufolie zu umwickeln damit die einzelnen Alufolienkappen nicht abgehoben werden (beim Erhitzen entweicht Luft die die Folie sonst wegschiebt).

13. Das Backrohr nach 30 Minuten abschalten und die Gläser bei geschlossener Ofentüre langsam abkühlen lassen. Wir setzen unsere Nährböden immer nach dem Abendessen an, dann wird der Herd nicht mehr benötigt und die Gläser können in Ruhe über Nacht abkühlen.

14. Ist das Backrohr ganz ausgekühlt, dann kann man die Gläser aus dem Rohr holen und an einem hellen Ort abstellen. Vorsicht bei Angreifen der Gläser damit man die Alufolie nicht unnötig bewegt (Kontaminationsgefahr). Man sollte die frischen Nährböden vor dem Gebrauch zumindest 5 Tage (besser eine Woche) stehen lassen weil in dieser Zeitspanne eventuelle Kontaminationen ausreichend Zeit haben zu wachsen. Sind die Gläser nach 5 Tagen immer noch steril, dann kann man ziemlich sicher davon ausgehen, dass die Nährböden für den weiteren Gebrauch (Aussaat, Umlegen, ...) brauchbar sind.

Herstellen von sterilen destillierten Wasser

Um steriles destilliertes Wasser zum Spülen der Samen zu bekommen, füllt man einfach etwas steriles Wasser in ein verschraubbares Glas, legt den Deckel lose auf das Glas und deckt den Deckel mit Alufolie ab. Das Glas kann dann gemeinsam mit den Nährböden 30 Minuten lang im Backrohr sterilisiert werden.

Von uns verwendete Nährböden: